Подход CRISPR «миниген» останавливает генетическое заболевание печени у мышей

crispr
                Кредит: CC0 Public Domain

Новая методика редактирования генов CRISPR предотвратила генетическое заболевание печени, вызванное сотнями различных мутаций, и улучшила клинические симптомы у мышей, сообщили исследователи из Penn Medicine в новом исследовании о концепции, опубликованном в Интернете в Science Достижения. Полученные данные свидетельствуют о перспективном инструменте CRISPR, который потенциально может лечить пациентов с редким метаболическим нарушением цикла мочевины, вызванным дефицитом фермента орнитин-транскарбамилазы (ОТС), а также другими наследственными заболеваниями, вызванными различными мутациями одного и того же гена.
                                                                                       

Подход CRISPR основан на предыдущем, разработанном в Penn Medicine, который ограничивался исправлением только одной мутации — он приносил пользу новорожденным мышам, но не взрослым. На этот раз метод, в котором используется новый, двойной аденоассоциированный вирус (AAV) для доставки его компонентов, вставил «миниген» в геном, чтобы обеспечить устойчивую экспрессию ОТС в клетках печени, что называется подход «вырезать» и «вставить». Никакие мутации не исправлены, скорее новый набор инструкций добавлен к клеткам. В результате исследователи наблюдали клиническую пользу у новорожденных мышей, которая поддерживалась в зрелом возрасте.

«Как и большинство генетических заболеваний, которые приводят к летальным последствиям у новорожденных, ранние методы лечения, которые эффективны в течение длительного времени, имеют важное значение», — сказал Джеймс Уилсон, доктор медицинских наук, профессор медицины и директор генной терапии. Программа и Центр лечения сирот в Пенне. «Здесь мы продвинули подход CRISPR вперед, чтобы не только поддерживать экспрессию ОТС в клетках, но и расширять возможности инструмента. Наша цель — в конечном итоге перевести этот подход к редактированию генов от животных для лечения пациентов с нарушениями ОТС и другими генетическими заболеваниями, вызванными мутациями, разбросанными по всему гену, а не одной преобладающей мутацией. «

Внебиржевое расстройство, встречающееся почти у одного из 40000 новорожденных, может быть вызвано более чем 300 различными мутациями гена ОТС. Поскольку эти мутации происходят в Х-хромосоме, она обычно встречается у мужчин, в то время как женщины являются носителями. Цикл мочевины представляет собой серию из шести ферментов печени, которые помогают избавить организм от аммиака. Когда один из этих ферментов отсутствует или в дефиците, аммиак накапливается в крови и попадает в мозг, что может вызвать повреждение мозга и даже смерть. Для лечения этого заболевания пациенты принимают лекарства для стимуляции альтернативных путей очистки азота или, в тяжелых случаях, трансплантации печени. Однако смертность у этих пациентов все еще высока, поэтому существует необходимость в более новых и более эффективных методах лечения.

Чтобы разработать широко применяемый инструмент для редактирования генома, команда создала новый двойной AAV-вектор, содержащий бактериальный белок с РНК-направляющей, известный как Cas9 — быстрый и надежный метод поиска и манипулирования генами в клетках. Известный как AAV8, этот разработанный Пенном вектор специфически обладает сродством к клеткам печени. Второй AAV содержал полностью функционирующий «миниген», экспрессирующий оптимизированный по кодонам человеческий ОТС — донорскую ДНК — управляемый специфичным для печени промотором, чтобы гарантировать, что он экспрессируется только в клетках печени при введении в кровь.

Первым этапом является создание разрыва в ДНК с помощью Cas9 в месте нацеливания вдоль гена («разрез»), что создает основу для добавления минигена в так называемую гомологичную репарацию, или HDR («вставить»).

«В отличие от других подходов CRISPR, которые удаляют или модифицируют часть нормального гена, этот метод объединяет новую часть», — сказал первый автор Лили Ван, доктор философии, профессор медицины. «Мы не пытаемся исправить мутации, которые мешают клеткам печени производить OTC, мы добавляем этот новый миниген, чтобы клетки могли».

У мышей, обработанных целевым вектором, было обнаружено 25 и 35 процентов клеток, экспрессирующих OTC, в печени через три и восемь недель соответственно, что в четыре и три раза выше, чем у мышей, получавших нецелевой вектор. В оба момента времени (три и восемь недель) большинство ОТС-позитивных клеток печени были расположены в кластерах, рассеянных по всем участкам печени у мышей-мишеней.

Исследователи также наблюдали 60-процентное снижение уровня аммиака у мышей-мишеней по сравнению с необработанными мышами, получавшими диету с высоким содержанием белка, что является клиническим признаком, свидетельствующим о том, что клетки печени вырабатывают безрецептурные клетки.

«Благодаря этим успешным исследованиям на животных мы приблизились к потенциальному подходу редактирования генов широкого спектра для лечения пациентов с дефицитом ОТС, независимо от мутации и клинического состояния», — сказал Уилсон. «Следующим шагом, с помощью дополнительных доклинических исследований, является поиск безопасного участка гавани гена в клетках печени человека, а затем проверка аналогичного подхода к редактированию генов».

Похожие новости

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *